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    實時熒光定量PCR

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    實時熒光定量PCR

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    如有各類設(shè)備采購需求，請聯(lián)系專屬顧問。
    項目介紹

    檢測各類樣品，如動植物組織、細胞液、全血等樣品中目標基因的存在以及相對含量。

    實驗流程：取材-RNA提取-測濃度-逆轉(zhuǎn)錄成cDNA-qPCR檢測-數(shù)據(jù)分析-發(fā)報告

    樣品要求

    1. 請?zhí)峁┮阎娜L基因序列和詳細背景資料：DNA/RNA來源，豐度；

    2. 請您提供新鮮的且盡量多的材料，或直接提供純化好的總RNA或DNA（大于5ug/樣本）。

    3. 動物組織：樣本離體應(yīng)當立即放入液氮或-80℃冰箱中速凍保存，避免反復(fù)凍融，并且樣本在-80℃的保存時間不宜過長，若保存時間超過半年應(yīng)及時與工作人員取得聯(lián)系，組織寄送100mg以上，脂肪組織，結(jié)締組織，纖維化組織適當增加，干冰運輸；

    4.植物：新鮮的葉、果肉、種子等最少需100mg，干冰運輸。

    5.細胞：1×10^6個細胞，加入trizol的細胞樣本（不要直接運輸加trizol的細胞培養(yǎng)皿），Trizol 為裂解液，不適用于組織樣本的保存，細胞除外，干冰運輸；

    6.全血：最少1 mL新鮮血液EDTA抗凝管，4度運輸； 血清：最少1 mL，干冰運輸；

    7.RNA樣品： OD260/280為1.8-2.0，濃度≥100 ng/μL，體積≥20μL，干冰運輸；cDNA：cDNA原液≥20 μL，干冰運輸；

    8. 對于完成實驗后，剩余樣本需要返還的項目，需在收到項目完整版結(jié)題報告一個月內(nèi)告知公司，逾期樣本將安排清理。如果樣本特別珍貴，需提前說明。一般情況下，樣本不予返還；樣本返回需要客戶承擔返還費用（包括干冰費和快遞費）。


    注意事項：在裝樣品的EP管上面做好標記，并且樣本命名應(yīng)與《項目送樣單》保持一致，并在送樣時用密封袋裝好；因樣本試提取或檢測均會消耗部分樣本，所以送樣樣本量需至少高于上述提及樣本量的三分之一，建議所有樣本均做好備份；

    項目案例

    內(nèi)參基因ACTIN（擴增曲線）

    內(nèi)參基因ACTIN(溶解曲線)

    內(nèi)參基因COL1(擴增曲線)

    內(nèi)參基因COL1（溶解曲線）

    COL1目的基因組柱狀圖

    常見問題
    1、1.無Ct值出現(xiàn)

    檢測熒光信號的步驟有誤:一般SybrGreen法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。

    1、引物或探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性。

    2、模板量不足:對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

    3、模板降解:避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

    2、2.Ct值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

    1、擴增效率低:反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針；改用三步法進行反應(yīng)；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

    2、PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。

    3、PCR產(chǎn)物太長:一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。

    3、3.溶解曲線不止一個主峰

    1、引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

    2、引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

    3、鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

    4、模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴增。

    4、4.擴增效率低

    1、反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

    2、反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。

    3、反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。

    實時熒光定量PCR

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