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    項(xiàng)目介紹

    通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究以揭示生物學(xué)現(xiàn)象或疾病發(fā)生的分子機(jī)制是高通量組學(xué)研究的一個(gè)常用策略。利用高通量測(cè)序技術(shù)在全面快速得到基因表達(dá)譜的同時(shí),還可以通過(guò)測(cè)定的序列信息精確地分析轉(zhuǎn)錄本的SNP、可變剪接等序列及結(jié)構(gòu)變異。

    技術(shù)特點(diǎn)

    1.除了計(jì)算基因的表達(dá)水平,更可以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本的序列和構(gòu)變異。

    2.測(cè)序深度的增加可以獲得更廣的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍,能夠同時(shí)鑒定和定量高豐度轉(zhuǎn)錄本和低豐度轉(zhuǎn)錄本,信號(hào)強(qiáng)度的跨度可達(dá)6個(gè)數(shù)量級(jí)。

    3. 除了檢測(cè)已知轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平外,還能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本。

    4. 在應(yīng)用于尚無(wú)參考基因組的物種時(shí),可以通過(guò)從頭組裝發(fā)現(xiàn)新基因。

    實(shí)驗(yàn)流程

    圖中深色為該實(shí)驗(yàn)流程

    分析流程

    標(biāo)準(zhǔn)分析

    (1) 數(shù)據(jù)過(guò)濾及比對(duì)分析

    (2) 轉(zhuǎn)錄本拼接

    高級(jí)分析

    (3) 差異表達(dá)基因篩選

    (4) 差異表達(dá)基因聚類分析

    (5) 使用GO/KEGG分析,推測(cè)突變基因富集在哪些代謝通路。


    樣品要求

    樣本要求

    RNA濃度≥20ng/ul ,總量≥2ug    

    細(xì)胞數(shù)≥5X106

    項(xiàng)目案列

    常見問(wèn)題

    真核轉(zhuǎn)錄組常規(guī)建庫(kù)流程

    1)通過(guò)磁珠和mRNA的polyA結(jié)構(gòu)將mRNA分離出來(lái);

    2)mRNA片段化;

    3)mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈結(jié)構(gòu),第二鏈cDNA合成時(shí),其中的堿基T,被替換成U,從而達(dá)到鏈特異性文庫(kù)的目的;

    4)5’末端修復(fù)、3’末端加A;

    5)加接頭;

    6)選擇特異長(zhǎng)度回收,一般為300bp;

    7)PCR;

    8)上機(jī)測(cè)序。

    原核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序用到哪些試劑?

    1)RNA提取:Trizol Reagent;

    2)核糖體RNA去除:IlluminaRibo-Zero? Magnetic Kit;

    3)文庫(kù)構(gòu)建:IlluminaTruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit;

    4)上機(jī)測(cè)序IlluminaNextSeq?500 High Output Kit v2。

    什么是小RNA測(cè)序?

    Small RNA測(cè)序,研究某一物種特定組織在特定狀態(tài)下的已知SmallRNA,也可發(fā)現(xiàn)新的或該物種的Small RNA并預(yù)測(cè)其靶基因,為研究Small RNA的功能及此物種的基因調(diào)控機(jī)制提供了有力工具。Small RNA主要包括微RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、與piwi相互作用的RNA(piRNA)三類。

    哪些物種可以研究lncRNA?

    要做lncRNA分析,對(duì)物種有以下要求:

    a. 物種為真核生物;

    b. 物種具有參考基因組;

    c. 具有較為完整的注釋。

    為什么CircRNA測(cè)序的研究比較熱?

    1)多角度闡述分子生物學(xué)問(wèn)題的需要;

    2)從新的角度發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致樣本存在差異的需要;

    3)尋找影響疾病發(fā)生的分子標(biāo)記;

    4)探究circRNA的未知功能;

    5)尋找導(dǎo)致microRNA表達(dá)發(fā)生變化的機(jī)理。

    全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是怎么做的?

    全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是將樣品分為兩份,構(gòu)建2個(gè)文庫(kù),1個(gè)小RNA文庫(kù)(包含miRNA)和一個(gè)去除核糖體的鏈特異性文庫(kù)(包含mRNA,lncRNA,和circRNA),然后分別上機(jī)測(cè)序,最后主要獲得4類RNA——miRNA,lncRNA,mRNA,circRNA的序列信息。

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