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蛋白質(zhì)免疫印跡實驗WB的關(guān)鍵步驟精講與演示
來源: 時間:2024-08-14 10:16:25 瀏覽:1427次

蛋白質(zhì)免疫印跡實驗WB的關(guān)鍵步驟精講與演示

 

蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western Blotting, WB)是一種用于檢測特定蛋白質(zhì)在樣品中的表達情況的技術(shù);它結(jié)合了電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移、抗原抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)等多個步驟,具有高度的靈敏性和特異性。

一、概述

蛋白質(zhì)免疫印跡實驗的基本原理是將蛋白質(zhì)通過電泳分離后,轉(zhuǎn)移至固相載體上,然后利用特異性抗體與目標蛋白質(zhì)結(jié)合,并通過顯色反應(yīng)或其他檢測手段揭示目標蛋白質(zhì)的存在和相對含量。

二、關(guān)鍵步驟

1. 樣品準備:蛋白質(zhì)提?。簭募毎蚪M織中提取蛋白質(zhì),通常使用含有去污劑和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液。蛋白質(zhì)定量:使用Bradford法、BCA法或Lowry法等對提取的蛋白質(zhì)進行定量。

2. 蛋白質(zhì)電泳制備SDS-PAGE凝膠:根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量選擇合適的凝膠濃度。加樣:將蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合后,上樣至凝膠中。電泳:在電泳儀中進行電泳,蛋白質(zhì)根據(jù)分子量大小在凝膠中分離。

3. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移準備轉(zhuǎn)移膜:通常使用PVDF膜或硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)移裝置:將凝膠、轉(zhuǎn)移膜和濾紙組裝在轉(zhuǎn)移裝置中。電轉(zhuǎn)移:在轉(zhuǎn)移緩沖液中,通過電場作用將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上。

4. 封閉使用含牛血清白蛋白(BSA)或脫脂奶粉的封閉液封閉膜上的非特異性結(jié)合位點,減少背景信號。

5. 抗體孵育一抗孵育:使用特異性一抗與目標蛋白質(zhì)結(jié)合,通常在4°C過夜孵育。洗膜:使用TBSTPBS緩沖液洗去未結(jié)合的一抗。二抗孵育:加入帶有酶標記的二抗,與一抗結(jié)合,室溫孵育1-2小時。

6. 顯色反應(yīng)使用化學發(fā)光底物或酶底物,通過顯色反應(yīng)產(chǎn)生信號,揭示目標蛋白質(zhì)的位置和相對含量。使用X光膠片或CCD相機拍攝圖像,進行定量分析。

三、注意事項與技巧

1. 確保樣品、抗體和試劑的質(zhì)量,避免交叉污染。

2. 控制電泳和轉(zhuǎn)移條件,確保蛋白質(zhì)分離和轉(zhuǎn)移的效果。

3. 優(yōu)化抗體孵育條件,包括抗體濃度和孵育時間。

4. 顯色反應(yīng)時,注意底物的濃度和反應(yīng)時間,避免過度顯色。

四、應(yīng)用

蛋白質(zhì)免疫印跡實驗廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物開發(fā)等領(lǐng)域,用于檢測蛋白質(zhì)的表達、修飾、相互作用等。

 

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全部 3小時前 四川
文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具?,F(xiàn)代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產(chǎn)生書面文字,很多小語種,有語言但沒有文字。文字的不同體現(xiàn)了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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