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實時熒光定量PCR實驗中會出現(xiàn)的問題有哪些？
來源：測試GO 時間：2022-10-28 11:34:10 瀏覽：4185次

在科研人員進行實時熒光定量PCR的實驗操作中遇到了不計其數(shù)的問題，本文就給大家分享在實驗過程中出現(xiàn)頻率最高的一些問題：

 內(nèi)參基因COL1(擴增曲線)

一、Ct值出現(xiàn)

檢測熒光信號的步驟有誤:一般SybrGreen法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。

1、引物或探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性。

2、模板量不足:對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

3、模板降解:避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

二、Ct值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

1、擴增效率低:反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針；改用三步法進行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

2、PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。

3、PCR產(chǎn)物太長:一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。

三、溶解曲線不止一個主峰

1、引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

2、引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

3、鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

4、模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴增。

四、擴增效率低

1、反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

2、反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴增法。

3、反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。


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全部 3小時前 四川
文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具。現(xiàn)代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產(chǎn)生書面文字，很多小語種，有語言但沒有文字。文字的不同體現(xiàn)了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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